RNase A

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Ribonuklease A (RNase A) ist eine Endoribonuklease, die spezifisch einzelsträngige RNA 3' zu Pyrimidinresten schneidet (Cytosin, Uracil). Dadurch entstehen Pyrimidin-3'-Phosphate oder Oligonucleotide mit endständigen Pyrimidin-3'-Phosphaten. Das pH-Optimum liegt im Bereich von 7,0 - 7,5. RNase A wird für die Reinigung von RNA-freier DNA, für die Entfernung von nicht-hybridisierten Regionen von RNA : DNA-Hybriden oder als Molekulargewichtsmarker verwendet. Das Enzym wird durch Diethylpyrocarbonat (DEPC), Guanidiniumsalz (4 M GuaSCN), β-Mercaptoethanol, Schwermetalle, Vanadylribonukleosidkomplexe, RNase-Inhibitor aus menschlicher Plazenta und durch kompetitive DNA gehemmt. Bezüglich letzterem ist denaturierte DNA wirksamer als native Nukleinsäuren. Trotzdem ist RNase A unter verschiedenen Bedingungen sehr aktiv und schwer zu inaktivieren. Bei niedrigen Salzkonzentrationen (bis zu 100 mM NaCl), schneidet RNase A einzel- und doppelsträngige RNA und RNA in RNA : DNA-Hybriden. Bei hohen Salzkonzentrationen (>300 mM NaCl) wird nur einzelsträngige RNA geschnitten. Um das Enzym aus den Proben zu entfernen, muss es mit Proteinase K verdaut werden. Meistens wird unterstützend SDS zugegeben (Endkonzentration 0,6 %). Anschließend sind einige Phenolextraktionen notwendig.Anwendungen: Enzymatische Manipulationen von DNA und RNA: Ref. 1 Suppl. 8 Seite 3.13.1; Minipreps von Plasmid-DNA: Ref. 1 Suppl. 24 Seite 1.6.6; in Situ-Hybridisierung von zellulärer RNA: Ref. 1 Suppl. 7 Seite 14.3.8; Entfernung von RNA aus Plasmidpräparationen: Ref. 2 Seite. 1.51) Stammlösungen werden in Konzentrationen von 1 - 10 mg/ml in 10 mM Tris · HCl, pH 7,5; 15 mM NaCl oder in 10 mM Tris · HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA, pH 8,0 (TE-Puffer) hergestellt. Die empfohlene Arbeitskonzentration liegt bei 10 μg/ml (Entfernung von RNA aus Plasmidpräparationen; 1 Stunde, RT) oder 100 ng/ml (Präparation von "blunt end" von doppelsträngiger cDNA).Einheitendefinition: Eine Einheit ist definiert als die Menge Enzym, die zur Hydrolyse von RNA mit einer Geschwindigkeitskonstanten, k = 1, bei 25°C und pH 5,0 führt (Kunitz-Einheit).Entfernung der DNase-Aktivität: Da RNase A hitzestabil ist, kann die Aktivität von DNasen, die hitzelabil sind, durch Aufkochen zerstört werden. RNase A kann in einer Konzentration von 10 mg/ml in 0,01 M Natriumacetat (pH 5,2) gelöst werden. Erhitzen Sie für 15 Minuten auf 100°C im Wasserbad. Das Wasserbad wird abgeschaltet, damit die RNase A langsam auf Raumtemperatur abkühlen kann. Durch Zugabe von dem 0,1fachen Volumen von 1 M Tris-Cl (pH 7,4) wird der pH-Wert eingestellt. Nach dem Aliquotieren wird das Produkt bei -20°C gelagert. Achtung: RNase präzipitiert, wenn konzentrierte Lösungen bei neutralem pH-Wert auf 100°C erhitzt werden! Außerdem sollte bei der Hitze-Inaktivierung von DNasen in RNase A - Lösungen immer bedacht werden, dass die in der Literatur beschriebene Prozedur möglicherweise nicht den gewünschten Erfolg hat und vielmehr das Risiko birgt, dass RNase A ausfällt und so einen Teil ihrer Aktivität einbüßt. Für Anwendungen, die absolute DNase-Freiheit erfordern, empfehlen wir deshalb unser Produkt A3832, RNase A (DNase-frei). Stabilität: RNase A aggregiert während der Lyophilisierung und der Lagerung. Das Enzym hat eine hohe Affinität zu Glas, was unbedingt beachtet werden muss. Bei neutralem pH (z. B. in PBS pH 7,4) und hohen Konzentrationen (> 10 mg/ml) fällt das Enzym aus. Bei \+4°C (lyophilisiert und trocken gelagert) ist es über mehrere Jahre, in Lösung (-20°C) ebenfalls für mehrere Jahre und bei (\+4°C) mehrere Wochen stabil.

Literature

(1) Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (1995) Current Protocols in Molecular Biology. Seite 3.13.1 Suppl. 8; Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York (2) Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition Seite A4.39. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. (3) Melton, D.A. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 7035-7056. Effiziente in vitro-Synthese von biologisch aktiver RNA und RNA-Hybridisierungsproben von Plasmiden, die den SP6-Promotor enthalten. (4) Winter, E. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7575-7579. Eine Methode zum Nachweis und zur Charakterisierung von Punktmutationen in transkribierten Genen.